Comparación de protocolos de desinfección de conductos radiculares convencionales y contemporáneos contra bacterias, ácido lipoteicoico (LTA) y lipopolisacárido (LPS)
La Junta de Revisión Institucional aprobó la recolección de dientes para este estudio en la Universidad de Maryland, Baltimore, MD (HP-00088564). Todos los métodos se realizaron siguiendo las pautas y regulaciones de la junta de revisión de la Universidad de Maryland. El comité de ética/IRB de la Universidad de Maryland Baltimore renunció a la necesidad de obtener el consentimiento informado. El cálculo del tamaño de la muestra se basó en un estudio previo19con referencia a un nivel de confianza del 95 %, un poder del 80 %, una diferencia de medias de 7,5 y una desviación estándar de 12 en relación con los recuentos bacterianos en Log10 UFC19. Se utilizó G*Power (versión 3.1.9.2) para garantizar que los resultados alcanzaran la potencia adecuada. La generación de secuencias aleatorias se obtuvo usando un número generado por computadora en www.randomizer.org. El ocultamiento de la asignación se realizó mediante la técnica de sobres opacos, sellados y numerados secuencialmente. Utilizamos 14 dientes por grupo en caso de pérdida durante el procesamiento. Se incluyeron setenta premolares mandibulares humanos de una sola raíz extraídos. Todos los dientes incluidos tenían un ápice radicular maduro, sin evidencia de reabsorción externa o interna, y un conducto único y recto (clasificación de Vertucci tipo I). Se tomó una radiografía para asegurarse de que los dientes no tuvieran tratamiento de conducto radicular previo, reabsorción, calcificaciones, canales laterales o curvatura. Se excluyeron los dientes con restauraciones extensas, caries, coronas, grietas o fracturas. Los dientes se limpiaron con curetas periodontales (Hu-Friedy, Chicago, IL, EE. UU.), se esterilizaron en autoclave durante 20 min a 121 °C utilizando un autoclave de vapor y se hidrataron en agua destilada.
Se accedió a todos los dientes con fresa redonda #4 y fresa Endo Z. Los canales se exploraron con una lima K # 10 (Dentsply Sirona, Charlotte, NC, EE. UU.) bajo un microscopio quirúrgico dental (DOM) (Global Surgical Corporation, St Louis, MO, EE. UU.). Se excluyeron los dientes con diámetros apicales superiores a la lima K # 15. La longitud de trabajo (WL) fue 1 mm más corta que el foramen apical. Para degradar posibles LPS preexistentes, todos los dientes se sometieron a radiación de gama con cobalto 60 (20 KGy durante 6 h)17,34.
Pretratamiento de dentina—El protocolo de pretratamiento de dentina se realizó de acuerdo a un estudio previo27. Brevemente, todos los dientes se sometieron a un baño ultrasónico durante 10 minutos en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 17 %, seguido de hipoclorito de sodio al 5,25 % (NaOCl).35. Los canales se empaparon con EDTA al 17%. Los dientes se colocaron en un tubo de plástico de 1,5 ml (Corning, Corning, NY) y se centrifugaron a 1400 g, 2000 g, 3600 g y 5600 g en secuencia durante 5 min. Después de cada ciclo, se renovó la solución de EDTA en los conductos radiculares. Repetimos este protocolo dos veces y los conductos radiculares se enjuagaron con 10 ml de NaOCl al 5,25 %. Los dientes se volvieron a colocar en el tubo de plástico de 1,5 ml y los canales se empaparon con NaOCl al 5,25 % y se centrifugaron como se describió anteriormente. Los conductos radiculares se irrigaron con 5 ml de tiosulfato de sodio estéril al 0,5 % y se enjuagaron con 5 ml de solución salina estéril, y los conductos se secaron con puntas de papel (PP) aprirogénicas/estériles.
Después del pretratamiento de dentina, se seleccionaron al azar 14 dientes como control negativo. La corona se desinfectó y se comprobó la esterilidad como se detalla más adelante. Se tomaron muestras de los conductos con PP estériles/apirogénicos, como se describe a continuación, para verificar la ausencia de infecciones preexistentes del conducto radicular. Antes de la molienda criogénica, las superficies externas de los dientes fueron desinfectadas según Siqueira30, y se tomaron muestras con hisopo de las superficies exteriores de los dientes, como se indica a continuación. Todas las muestras de control negativo se procesaron adicionalmente para análisis bacterianos, LPS y LTA.
Infección del conducto radicular—Una bacteria grampositiva, E. faecalis (ATCC 29212), y una bacteria gramnegativa, Escherichia coli Se utilizaron GFP (ATCC 25922). E. coli GFP es un clon derivado de ATCC 25922 que contiene un vector multicopia que codifica la proteína fluorescente verde GFPmut3 para detección/imágenes de fluorescencia. Un cultivo puro aislado de 24 h de E. faecalis se cultivó en agar BHI y luego se suspendió en 5 ml de caldo BHI (BD Difico, Sparks, MD); y un cultivo puro aislado de 24 h de E. coli GFP se cultivó en Tryptic Soy Agar (BD Difco) con 100 mcg/ml de ampicilina suspendida en 5 ml de caldo BHI. El E. faecalis y E. coli suspensiones de células se ajustaron espectrofotométricamente para que coincida con la turbidez de 1,5 × 108 CFU/ml (equivalente a ± 0,5 estándar de McFarland) y se inocularon todos los canales. Los dientes se mantuvieron en un tubo de plástico y se incubaron a 37 °C (Heratherm; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Los canales se inocularon con BHI recién preparado cada dos días durante 21 días para obtener una biopelícula de 3 semanas.
Posteriormente, se seleccionaron aleatoriamente 14 dientes infectados como control positivo de la infección. Las coronas de los 14 dientes fueron desinfectadas y probadas para esterilidad, como se mencionó anteriormente. Se tomaron muestras de los canales con PP, como se describe a continuación, para confirmar la infección. Las superficies externas de los dientes fueron desinfectadas según Siqueira et al.30 y probado para la esterilidad. Siete dientes se trituraron criogénicamente para verificar la presencia de bacterias, análisis de LTA y LPS según lo especificado. Los otros siete dientes se procesaron aún más para el análisis microscópico de barrido láser confocal (CLSM).
Análisis microscópico de barrido láser confocal (CLSM)—Para el análisis CLSM, los dientes se seccionaron horizontalmente en los tercios cervical, medio y apical utilizando discos Isomet de 0,3 mm en un cortador de precisión Isomet 1000 (Isomet Buehler, Lake Bluff, IL) enfriado con agua destilada estéril. Las muestras se colocaron individualmente en placas de cultivo de 24 pocillos esterilizadas y apirógenas. Se usó el Fluorescence SpectraViewer (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) para evaluar la compatibilidad espectral del colorante con la tinción. E. faecalis (Excitación: 346; Emisión: 442) en azul, con E. coli GFP que contiene un vector multicopia que codifica la proteína verde fluorescente GFPmut3 para fluorescencia (Excitación: 505 nm; Emisión: 525 nm). Las muestras se llevaron a CLSM (Nikon W-1 Spinning Disk) utilizando lentes de aceite de 5x, 10x y 40x. Las muestras de imágenes se adquirieron 10 μm por debajo de la superficie. Cifra 2 ilustra este nuevo modelo de biopelícula de doble especie bajo CLSM, con E. faecalis en azul y E. coli GFP en verde.
Protocolos de muestreo y desinfección de conductos radiculares
Las muestras del conducto radicular se recolectaron antes (s1), después de la desinfección (s2) con PP y después de la molienda criogénica (s3), como se describe a continuación.
Antes de las muestras del conducto radicular, la corona se descontaminó y desinfectó con H2O2 al 30 % (volumen/volumen) durante 30 s, luego con NaOCl al 5,25 % durante 30 s y luego se neutralizó con tiosulfato de sodio al 5 %.2,7. La desinfección de la corona se comprobó tomando una muestra de hisopo de la superficie de la corona y extendiéndola en una placa de agar BHI (BD Difco), incubando a 37 °C en un CO2 incubadora durante 72 h y se verificó el crecimiento bacteriano. Las muestras del conducto radicular se realizaron de manera similar al procedimiento de Louzada et al.36. En primer lugar, para la investigación de LPS, se tomaron muestras de los canales con PP estériles/apirogénicos (Dentsply Sirona), que se llevaron a la WL, se mantuvieron en posición durante 60 s, se transfirieron a un tubo estéril/apirógeno de 1,5 ml y se congelaron a -80ºC. °C para análisis LPS adicionales, como se describe a continuación. En segundo lugar, para la investigación bacteriana, se introdujeron tres PP estériles/apirogénicos en el WL uno a la vez, se mantuvieron en posición durante 60 s y se transfirieron a un tubo estéril/apirógeno de 1,5 ml que contenía 1 ml de caldo BHI (BD Difco), e inmediatamente procesados para cultivos bacterianos adicionales. Por último, se colocó un PP estéril/apirógeno en la WL, se retuvo en posición durante 60 s, se transfirió a un tubo estéril/apirógeno de 1,5 ml y se congeló a -80 °C para su posterior análisis de LTA.
Cuarenta y dos dientes se dividieron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento: GWS (sistema GentleWave) + MIT (técnica mínimamente invasiva), PUI (irrigación ultrasónica pasiva) + CIT (técnica de instrumentación convencional), XP-EF (XP-endo Finisher) + CIT (Todos, n = 14). Los conductos radiculares se instrumentaron con limas rotatorias Vortex Blue (Dentsply Sirona) a 500 rpm. En el grupo de instrumentación mínimamente invasiva (MIT), los conductos radiculares se instrumentaron con una lima rotatoria Vortex Blue de tamaño # 20/0.04 en el WL, mientras que en los grupos CIT (técnica de instrumentación convencional), los conductos se ampliaron utilizando una técnica de corona hacia abajo. con un tamaño # 35/0.06, # 30/0.06 y 25/0.06, avanzando secuencialmente hacia el WL, hasta que un tamaño # 35/0.04 alcanzó el WL. Los conductos se irrigaron con hipoclorito de sodio al 3% (NaOCl) después de cada lima y se comprobó la permeabilidad con la lima manual K del n.° 10. Los protocolos de desinfección XP-EF, GWS y PUI probados aquí se describen en la Tabla 1. Después de los procedimientos de conducto radicular, se realizó un segundo muestreo del conducto radicular (s2), como se describió anteriormente.
Técnica de trituración criogénica para análisis de desinfección intrarradicular—Para investigar las infecciones intrarradiculares de bacterias restantes, LTA y LPS, se seccionó la corona y la raíz se trituró criogénicamente y se pulverizó (s3). El protocolo para la molienda criogénica se informa en otra parte27. Brevemente, los dientes se colocaron individualmente en un tubo cilíndrico de acero inoxidable dentro del congelador/molino 6770 SPEX SamplePrep (Spex, Metuchen, NJ). Sumergimos el tubo que contenía los dientes en nitrógeno líquido durante todo el ciclo de rectificado. La máquina de congelación/molienda enfría las muestras a temperaturas criogénicas y las pulveriza al mover magnéticamente un impactador de acero de un lado a otro contra dos tapones de extremo estacionarios. La molienda criogénica incluyó el siguiente protocolo: (a) preenfriamiento durante 10 min; (b) el primer ciclo, en el que las muestras se molieron durante 1 min a una velocidad de 10 ciclos por segundo; (c) enfriamiento durante 1 min; (d) el segundo ciclo, en el que las muestras se molieron durante 1 min; (e) enfriamiento durante 1 min; y (f) el tercer ciclo, en el que las muestras se molieron durante 1 min. El tiempo total de molienda fue de 15 min.
Todas las muestras s1, s2 y s3 recolectadas se procesaron para análisis bacterianos, LTA y LPS.
Análisis bacteriano, LTA y LPS
Cultivo bacteriano (recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)):El…